|
|
Sitogenetik
GİRİŞ
Kromozomal hastalıkların önemli bir bölümü, kromozomların sayı ve yapılarında meydana gelen değişimler sonucu ortaya çıkmaktadır. Sitogenetik, kromozomların, yapısal ve sayısal değişikliklerini inceleyen bilim dalıdır. Gebeliklerde görülen kromozomal anomaliler, en ağır şekilde gebelik kayıpları ile sonuçlanmakta, yaklaşık 1/100 infantta ağır konjenital malformasyonlar, mental retardasyon, gelişme geriliği, cinsiyet anomalileri yada sadece öğrenme güçlüğü ve davranış bozuklukları ile kendini göstermektedir.
|
En sık görülen kromozomal hastalıklar
|
Görülme Sıklığı
|
|
Trizomi 21 (Down Sendromu)
|
1 / 900 -1 / 1500
|
|
Trizomi 18 (Edwards Sendromu)
|
1 / 3000 – 1 / 8000
|
|
Trizomi 13 (Patau Sendromu)
|
1 / 5000 – 1 / 25 000
|
|
XXY (Klinefelter Sendromu)
|
1 / 1000
|
|
45,X (Turner Sendromu)
|
1 / 5000 Kız Doğum
|
|
XYY Sendromu
|
1 / 1000 Erkek Doğum
|
|
XXX Sendromu
|
1 / 1000
|
SİTOGENETİK ANALİZ PROTOKOLLERİ
Sitogenetik analizler, kişinin ve/veya rahatsızlığın durumuna göre farklı materyallerden elde edilen kromozomlarla yapılabilir. Kromozom analizlerinin başlıca aşamaları ve materyalleri aşağıda sıralanmıştır.
> Kromozom analizlerinde ortak işlemler
> Prenatal tanı (Amniyon hücreleri, kord kan örneği, koryon villüs biyopsisi materyali)
> Postnatal tanı (Periferik Kan, kemik İliği, fibroblast (cilt doku) materyali)
> Postmortem tanı (Abort materyali, plasenta dokusu, fibroblast materyali, kord kanı...)
SİTOGENETİK ANALİZLERDE KULLANILAN KİMYASAL VE PLASTİKLER
Türkiye’nin birçok sitogenetik laboratuarında medyum ve katkı maddeleri olarak Biological Industries markası kullanılmaktadır. Dünyada ve İsrail’de birçok bilimsel kuruluşla birlikte çalışan ve ISO 13485 (GMP) standarlarında üretim yapan Biological Industries firmasının sitogenetik ürünleri CE işaretine sahiptir.
Sitogenetik analizlerde kullanılan bazı solüsyonlar Dr. Zeydanlı tarafından da üretilmektedir. Dr. Zeydanlı, özellikle solüsyon olarak bu alanda kullanılan Türkiye’nin ilk yerli markası olma özelliğini taşımaktadır. Tüm ürünlerimizde CE işareti bulunmaktadır.
Sitogenetik alanında ihtiyacınız olan tüm plastik malzemeleri ise ISO sertifikalı Corning’de bulmanız mümkündür. Plastik alanında dünyanın sayılı markaları arasında yer alan Corning, tüm ürünlerini non-projenik sertifika ile garantilemiştir.
Kullanılacak Malzemeler ve gerekli cihazlar:
Bio Amf 1 (Bio. Ind., 01-190-1 ve 01-192-1)
Bio Amf 2 (Bio. Ind., 01-194-1)
Bio Amf 3 (Bio. Ind, 01-196-1)
RPMI 1640 (Bio. Ind., 01-106-1)
Fetal Calf Serum (Bio. Ind., 04-007-1)
Peripheral Blood Karyotyping Medium with PHA-M (Bio. Ind., 01-201-1)
Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M (Bio. Ind., 01-198-1)
Bone Marrow Karyotyping Medium (Bio. Ind., 01-199-1)
Hematopoietic Cell Karyotyping Medium (Bio. Ind., 01-200-1)
Phytohemaglutinin M (PHA-M) (Bio. Ind., 12-006-1)
Colsemid (Bio. Ind., 12-004-1)
Penisilin/Streptomisin (Bio. Ind., 03-031-1)
L-Glutamin (Bio. Ind., 03-020-1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
PBS 1X Solüsyon Ca ve Mg içermez (Dr. Zeydanlı, DZPBS1-1)
KCl 0.075 M Solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Sodyum sitrat (Serva, 38642)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Flask (Corning, 430168)
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Petriler (Corning, 430165, 430166, 430167)
Pipet Tabancası (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Kurutma Fırını
Laminair Flow
Vorteks (Boeco, 8085000)
Mikroskop ve karyotip görüntüleme sistemi
Etüv
Santrifüj U 320 Model (Boeco, 01401-13)
Bio Amf 2 (Bio. Ind., 01-194-1)
Bio Amf 3 (Bio. Ind, 01-196-1)
RPMI 1640 (Bio. Ind., 01-106-1)
Fetal Calf Serum (Bio. Ind., 04-007-1)
Peripheral Blood Karyotyping Medium with PHA-M (Bio. Ind., 01-201-1)
Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M (Bio. Ind., 01-198-1)
Bone Marrow Karyotyping Medium (Bio. Ind., 01-199-1)
Hematopoietic Cell Karyotyping Medium (Bio. Ind., 01-200-1)
Phytohemaglutinin M (PHA-M) (Bio. Ind., 12-006-1)
Colsemid (Bio. Ind., 12-004-1)
Penisilin/Streptomisin (Bio. Ind., 03-031-1)
L-Glutamin (Bio. Ind., 03-020-1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
PBS 1X Solüsyon Ca ve Mg içermez (Dr. Zeydanlı, DZPBS1-1)
KCl 0.075 M Solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Sodyum sitrat (Serva, 38642)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Flask (Corning, 430168)
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Petriler (Corning, 430165, 430166, 430167)
Pipet Tabancası (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Kurutma Fırını
Laminair Flow
Vorteks (Boeco, 8085000)
Mikroskop ve karyotip görüntüleme sistemi
Etüv
Santrifüj U 320 Model (Boeco, 01401-13)
BIO AMF-1 (Biological Industries, Basal 01-190-1, Suplement 01-192-1)
Amniyosentez, CVS, abort, plasenta ve cilt doku için uygun bir medyumdur. Basal ve supplement olarak ayrılmıştır. Bir medyuma ilave edilmesi gereken serum ve destek ürünlerin hemen tamamı supplement kısmında bulunur. Supplement kullanılmaya başlanmadan önce sıcak su banyosunda 37 0C de eritilir ve basal mediumun içine boşaltılır. Daha sonra 2cc L-Glutamin ve 1 cc Pen/strep eklenir. Bu şekilde elde edilen 100 ml medyum kullanıma hazırdır. Bu medyum kullanılmadığı zaman +2/8 0C sıcaklıkta muhafaza edilmeli ve en fazla 1 hafta içinde tüketilmelidir.
BIO AMF-2 (Biological Industries, 01-194-1)
Amniyosentez ve CVS için uygun bir medyumdur. Medyum complete şeklinde hazırlanmıştır. Bir medyumun ihtiyacı olabilecek olan serum ve destek ürünler Bio Amf -2’nin içeriğinde bulunmaktadır. Medyum kullanılmaya başlanmadan önce sıcak su banyosunda 37 0C de eritilir ve daha sonra içine 1 cc L-Glutamin eklenir. Oluşan medyum kullanıma hazırdır. Bu medyum kullanılmadığı zaman +2/8 0C sıcaklıkta muhafaza edilmeli ve en fazla 1 hafta içinde tüketilmelidir.
BIO AMF-3 (Biological Industries, 01-196-1)
Amniyosentez ve CVS için uygun bir medyumdur. Medyum complete şeklinde hazırlanmıştır ve kullanılmaya başlanmadan önce sıcak su banyosunda 37 0C de eritilmelidir. Bu medyum kullanılmadığı zaman +2/8 0C sıcaklıkta muhafaza edilmeli ve en fazla 1 hafta içinde tüketilmelidir.
RPMI 1640 (Biological Industries, 01-106-1)
Hücre kültüründe en sık kullanılan medyumlardan birisidir. Özellikle periferik kan ve fibroblast hücrelerinin çoğaltılmasında kullanılır. İçerisinde serum ve antibiyotik ihtiva etmez. Kullanılmadan önce eklenmelidir. İlerleyen bölümlerde medyum hakkında ayrıntılı bilgi bulabilirsiniz.
Fetal Calf Serum (Biological Industries, 04-007-1)
Fetal Calf Serum, medyuma, hücrelerin çoğalması yönünde destek veren ürünlerden birisidir. Bir medyum için seçilecek fetal calf serum, medyumun içeriğine, kültürü yapılacak hücre tipine ya da yönteme göre değişebilir. Farklı çeşitlerdeki fetal calf serum için www.bioind.com 'u inceleyebilirsiniz.
Peripheral Blood Karyotyping Medium with PHA-M (Biological Industries, 01-201-1)
Özellikle periferik kan hücre kültürleri için kullanılan bir medyumdur. Medyum complete şeklinde hazırlanmıştır ve kullanılmaya başlanmadan önce sıcak su banyosunda 37 0C de eritilmelidir. Bu medyum kullanılmadığı zaman +2/8 0C sıcaklıkta muhafaza edilmeli ve en fazla 1 hafta içinde tüketilmelidir
Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M (Biological Industries, 01-198-1)
Özellikle periferik kan hücre kültürleri için kullanılan bir medyumdur. Bir medyuma ilave edilmesi gereken serum ve destek ürünlerin hemen tamamını içeriğinde bulundurur. Medyum kullanılmaya başlanmadan önce sıcak su banyosunda 37 0C de eritilir ve daha sonra içine 2-4 cc P-HAM eklenir. Oluşan medyum kullanıma hazırdır. Bu medyum kullanılmadığı zaman +2/8 0C sıcaklıkta muhafaza edilmeli ve en fazla 1 hafta içinde tüketilmelidir.
Bone Marrow Karyotyping Medium (Biological Industries, 01-199-1)
Özellikle kemik iliği hücre kültürleri için kullanılan bir medyumdur. RPMI bazlıdır ve içerisinde L-Glutamin ve antibiyotikleri ihtiva eder. Kemik iliği hücrelerinin üremesi normal hücrelere göre daha hızlı olduğu için medyum herhangi bir mitojen ajan (PHA-M) içermez. Medyum kullanılmaya başlanmadan önce sıcak su banyosunda 37 0C de eritilmelidir. Bu medyum kullanılmadığı zaman +2/8 0C sıcaklıkta muhafaza edilmeli ve en fazla 1 hafta içinde tüketilmelidir
Hematopoietic Cell Karyotyping Medium (Biological Industries, 01-200-1)
İnsan hematopoetik hücre kültürü için kullanılan bir medyumdur. Medyum kullanılmaya başlanmadan önce sıcak su banyosunda 37 0C de eritilmelidir. Bu medyum kullanılmadığı zaman +2/8 0C sıcaklıkta muhafaza edilmeli ve en fazla 1 hafta içinde tüketilmelidir
Phytohemaglutinin M (PHA-M) (Biological Industries, 12-006-1)
Hücreleri mitoza yönlendiren (mitojenik) bir ajandır. Lektin yapısındadır ve Phaseolus vulgarise ' den elde edilmiştir . Steril liyofilize toz halindedir ve kullanılmadan önce 5 ml distile su ile sulandırılmalıdır.
Kolsemid (Biological Industries, 12-004-1)
Hücre bölünmesini mitozun metafaz aşamasında durduran bir ajandır. Amniyosentez, CVS ve periferik kan hücre kültürlerinin sonlandırılması için kullanılır. 10 µg /ml konsantrasyonda PBS içerisinde bulunmaktadır. Tavsiye edilen kullanım oranı 1 ml’lik medyumda 0.1 µg dır.
Penisilin/Streptomisin Solüsyonu (Biological Industries, 03-031-1)
Hücre kültürünü çeşitli mantar ve maya kontaminasyonuna karşı korumak için. Solüsyonun 1 ml’sinde 10.000 ünite penisilin G ve 10 mg streptomisin sülfat bulunur. 100 ml’lik medyum için 1-2 ml kullanılması yeterlidir.
L-Glutamin (Biological Industries, 03-020-1)
Hücre gelişimini sağlayacak, büyümesini tetikleyecek bir tür katkı maddesidir. 200 mM konsantrasyondadır. 100 ml’lik medyumda 1-2 ml kullanılması yeterlidir.
PBS (Phosphate–Buffer-Saline) 1X Solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZPBS1-1)
PBS solüsyonu kromozomları boyama işleminde kullanılan bir tampondur. Kalsiyum ve magnezyum içermez.
KCl 0.075 M Solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
KCl solüsyonu 0.075 M konsantrasyondadır ve hücrelerin üremesi tamamlandıktan sonra, hücreleri patlatıp kromozomların açığa çıkması için kullanılır. Solüsyonun kullanıldığı aşamaya hipotonik aşaması da denmektedir.
Sodyum Sitrat (Serva, 38642)
Sodyum sitrat CVS hücrelerinde hipotonik amaçlı kullanılan solüsyonun yapımında kullanılır. 0.8 g / 100 ml distile su olacak şekilde hazırlanmalı ve soğutulmuş olarak kullanılmalıdır. Serva, üretmiş olduğu moleküler biyolojik grade kimyasallar ile çalışmalarınızda daha kaliteli sonuçlar almanızı sağlamaktadır.
Na2HPO4.2H2O (Serva, Kat No: 30200)
Na2HPO4.2H2O, örnekleri giemsa ile boyama işleminde kullanılan yardımcı solüsyonların hazırlanması için kullanılır. Serva, üretmiş olduğu moleküler biyolojik grade kimyasallar ile olumlu sonuçlar almanızı sağlamaktadır.
NaH2PO4.H2O (Amresco, Kat No: 0823)
NaH2PO4.H2O, örnekleri giemsa ile boyama işleminde kullanılan yardımcı solüsyonların hazırlanması için kullanılır. Amresco, üretmiş olduğu moleküler biyolojik grade kimyasallar ile olumlu sonuçlar almanızı sağlamaktadır.
Flask 25 cm2 (Corning, Kat No: 430168)
Flasklar, amniyosentez ve CVS başta olmak üzere, hücre kültürlerinin yapıldığı plastik malzemelerdir. Corning özel kapak tasarımları ile hücrelerin in-vitro kültür ortamlarında çoğalmalarını daha kolay hale getirmektedir. Yine özel çalışmalar için iç yüzeyi farklı bir teknikle muamele edilmiş olan CellBIND® flaskları, bir çok araştırmada efektif biçimde kullanılabilen flasklardır.
Kültür tüpleri (Corning, 430766)
Daha çok periferik kan ya da kemik iliği kültürlerinin yapıldığı, polipropilen yapıdaki malzemelerdir.
Disposable pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Disposable pipetler medyum ve kültür transferleri için kullanılır. Corning, ürettiği farklı büyüklüklerdeki (2 ml, 5 ml, 10 ml…) tek tek paketlenmiş disposable pipetleri ile steril çalışmayı daha kolay hale getirmekte ve çalışmalarınızın olumlu sonuçlar vermesini sağlamaktadır.
Petriler (Corning, 430165, 430166, 430167)
Disposable petriler de flasklar gibi farklı birçok çeşit hücrenin kültüründe kullanılan plastik malzemelerdir. Corning, farklı büyüklüklerde (35 mm, 60 mm ve 100 mm) ürettiği petri kapları ile kültür çalışmalarını kolaylaştırmaktadır.
Pipet Tabancası (Boeco, 9500000)
Boeco tarafından üretilen pipet tabancası (pipet aid), 1-100 ml arasında tüm plastik ve cam pipetlerle kullanılabilen pipetleme aletidir. Kablosuz ve şarj edilebilir özellikte olması özellikle steril koşullardaki kullanımını kolaylaştırmaktadır.
Vorteks V1 Plus (Boeco,8085000)
Vorteks kültür çalışmalarının hipotonik ve fiksatif aşamasında kullanılır. Boeco’nun ürettiği vorteksin hız ayarı cihaz üzerinde bulunan bir düğme yardımı ile değiştirilebilmektedir. Cihazın sürekli çalışma seçeneğinin yanında baskı ile çalıştırılma seçeneği de mevcuttur. 1,5 ml’den 50 ml’ye kadar tüpler için uygundur.
Santrifüj U 320 Model (Boeco, 01401-13)
Sitogenetik alanında kullanılacak santrifüjün 15 ml tüplere uyumlu 1000-4000 rpm de olması yeterlidir. Bu çalışmalar için soğutmalı santrifüje gerek yoktur. Boeco’nun U320 model santrifüjü 10 dan fazla rotor ve adaptör seçeneği ile her türlü çalışmaya ve tüm laboratuar koşullarına uygun hale getirilebilmektedir. Kültür için kullandığınız tüpün rotora uyumlu olmasına dikkat etmeniz yeterlidir.
Birçok sitogenetik çalışmasında materyaller farklı olsa da bazı işlemler ortaktır. Bu işlemler;
Hipotonik solüsyon ile hücrelerin parçalanması:
Hipotonik solüsyon olarak 0.075 M KCl (pH=7.2 – 7.4) kullanılmaktadır. Parçalama işlemi genellikle vorteks üzerinde tüpün tutulması ile yapılır. Yaklaşık 10 cc hipotonik kullanılır. Bu aşamada üretilen hücrelerin duvarları parçalanarak çekirdek yapısının ortaya çıkması sağlanır. Hücrelerin hipotonik solüsyon içerisinde 37 0C de belirli bir süre bekletilmesi tavsiye edilir. Bu süre laboratuar koşullarına göre farklılık gösterir. Bu aşama, analizi yapılabilecek kaliteli metafaz plakları elde etmek için çok önemlidir.
Fiksatif solüsyonu ile yıkama :
Fiksatif solüsyonu 1/3 oranında asetik asit/metanol’den oluşur ve soğutulmuş olarak kullanılması tavsiye edilir. Fiksasyon, parçalanmış hücrelerin protein kısımlarının atılması için yapılan bir yıkama işlemidir. Hipotonik aşamasından sonra santrifüjde çevrilen tüplerin süpernatantları atılır ve üzerlerine yaklaşık 10 cc fiksatif koyulur, karıştırılır ve santrifüj edilir. Bu işlem birkaç kez tekrarlanarak örnek yayma aşamasına getirilir.
Yayma:
Yayma işlemi, hipotonik ve fiksasyondan geçirilerek hazırlanan hücre karışımının lam üzerine damlatılmasıdır. Uygun bir mesafeden damlatılan karışımın içerisindeki metafaz alanları dağılmadan, mikroskop altında incelemeye müsait hale gelir. Yayma işlemi için kullanılacak lamlar, işlemden önce soğutulmalıdır. Yayma yapıldıktan sonra örnekler kurutma fırınında yaklaşık 24 saat kurutulur.
Giemsa ile boyama (G-Bantlama):
Giemsa Solüsyonunun Hazırlanışı:
53 ml Solüsyon A ve 47 ml Solüsyon B karıştırılır ve içine 12 damla Giemsa boyası damlatılır.
Sol A: Na2HPO4.2H2O 6.9 gr
Distile su 500 ml
Sol B: NaH2PO4.H2O 6.9 gr
Distile su 500 ml
Boyama işlemi 3 şale ile gerçekleştirilir.
Sol A: Na2HPO4.2H2O 6.9 gr
Distile su 500 ml
Sol B: NaH2PO4.H2O 6.9 gr
Distile su 500 ml
Boyama işlemi 3 şale ile gerçekleştirilir.
1.şale’de 80 ml PBS içinde çözülmüş toz tripsin*,
2.şale’de sadece PBS,
3.şalede de giemsa solüsyonu bulunmaktadır.
Yayma aşamasından sonra kurutulan lamlar, ilk şale içinde bir süre* bekletilir. Bu şale içerisindeki tripsin enzimi sayesinde kromozomların belirgin bölgelerinde oyuklar oluşur. İkinci şalede hafifçe çalkanarak enzimi yıkanan lamlar 3. şaleye koyulur. 3. şalede tripsinin oluşturduğu oyuklar giemsa ile boyanır. Bir hücredeki tüm kromozomların kendine özgü boyanabilen bölgeleri olduğu için bu aşama sonrasında kromozomlar birbirlerinden ayrılabilir.
(*)Tripsin miktarı ve süreler laboratuar koşullarına göre optimize edilmelidir. Ortalama olarak 0.04 g tripsin kullanılabilir. Tripsin de bekletme 5-10 sn., giemsada bekletme 3-5 dk. olabilir. Ancak bu süre ve miktarlar, örneğe, materyale, kimyasallara ya da laboratuara göre çeşitlilik göstermektedir.
Analiz:
2.şale’de sadece PBS,
3.şalede de giemsa solüsyonu bulunmaktadır.
Yayma aşamasından sonra kurutulan lamlar, ilk şale içinde bir süre* bekletilir. Bu şale içerisindeki tripsin enzimi sayesinde kromozomların belirgin bölgelerinde oyuklar oluşur. İkinci şalede hafifçe çalkanarak enzimi yıkanan lamlar 3. şaleye koyulur. 3. şalede tripsinin oluşturduğu oyuklar giemsa ile boyanır. Bir hücredeki tüm kromozomların kendine özgü boyanabilen bölgeleri olduğu için bu aşama sonrasında kromozomlar birbirlerinden ayrılabilir.
(*)Tripsin miktarı ve süreler laboratuar koşullarına göre optimize edilmelidir. Ortalama olarak 0.04 g tripsin kullanılabilir. Tripsin de bekletme 5-10 sn., giemsada bekletme 3-5 dk. olabilir. Ancak bu süre ve miktarlar, örneğe, materyale, kimyasallara ya da laboratuara göre çeşitlilik göstermektedir.
Analiz:
Her hastadan 20 metafaz alanı analiz edilir, mozaisizm gibi durumlarda bu sayı en az 30’a, metafazlar yeterli ise 100 alana çıkılır. Sayımda, bir alanda kromozom sayısının 46 olup olmadığı kontrol edilir. Analiz de ise plaktaki kromozomlar tek tek adlandırılır ve eksik kromozom olup olmadığına bakılır. Sayım normal 100 okülerlik mikroskopta yapılır. Analiz için de yine aynı mikroskop kullanılabilir ama metafaz plağının resimlendirilmesi için farklı firmalarca tasarlanmış özel görüntüleme sistemleri gerekmektedir (Şekil 1).
PRENATAL TANI PROTOKOLLERİ
AMNİYON HÜCRELERİNDE KROMOZOM ANALİZ PROTOKOLÜ (AMNİYOSENTEZ)
AMNİYON HÜCRELERİNDE KROMOZOM ANALİZ PROTOKOLÜ (AMNİYOSENTEZ)
Amniyosentez nedir?
Amniyosentez, yaklaşık 20 cc amniyon sıvısının rahim içinden ince bir iğne aracılığı ile çekilmesidir. Anne karnındaki bebeğin, gelişimi ve pek çok genetik hastalık bakımından durumu hakkında sıvının ve sıvı içindeki hücrelerin incelenmesi ile bilgi sahibi olunabilmektedir (Şekil 2).
Amniyosentez kimlere ve ne zaman uygulanır?
Amniyosentez giriş kısmındaki tabloda belirtilen prenatal tanı gerektiren durumların hemen hepsinde uygulanır. Diğer yöntemlere göre uygulanması daha kolay ve riski azdır. En erken 13.-15. gebelik haftasında (erken amniyosentez), genel uygulamada 16-20. gebelik haftaları arasında yapılır.
Amniyosentezin riskleri nelerdir?
Amniyosentez çalışmalarında hastadan materyal alımı düşük de olsa riskli bir durumdur. İşlem sırasında enfeksiyon kapılması düşüğe neden olabilmektedir. Anne yaşı ve gebelik haftası göz önüne alınarak, düşüğe yol açma oranı değerlendirildiğinde, amniyosenteze bağlı düşük oranının %0.3 ile %1.2 arasında olduğu görülür. Genel olarak deneyimli kişilerce yapılan amniyosentez sonrası girişime bağlı fetal kayıp oranı %0.5-1dir. Enfeksiyon, amniyotik sıvı sızması ve fetüsün girişim esnasında yaralanmasına bağlı fetal kayıp daha da düşük orandadır.
Kullanılacak Malzemeler:
Bio Amf 1 (Bio. Ind,01-190-1 ve 01-192-1), Bio Amf 2 (Bio. Ind,01-194-1) yada Bio Amf 3 (Bio. Ind,01-196-1) isteğe bağlı olarak herhangi bir tanesi
Colsemid (Bio. Ind,12-004-1)
Tripsin EDTA Solüsyon C(Bio. Ind., 03-053-1)
PBS 1X Solüsyon Ca ve Mg içermez (Dr. Zeydanlı, DZPBS1-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Flask (Corning, 430168)
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Medyum Özelliği:
Biological Industries firması, paralel çalışmaları ve laboratuar koşullarındaki farklılıkları göze alarak amniyosenteze uyumlu üç farklı medyum üretmektedir. Bio-Amf ismi verilen ve amniyosentez çalışmasına uygun olan bu medyumlardan, kullanıcı istediği ikisini ya da tek bir medyumun farklı lotlarını paralel olarak çalışabilir. Bio Amf 1, 2 ve 3’ün özellikleri “Sitogenetik Analizlerde Kullanılan Kimyasal ve Plastikler” başlığı altında açıklanmıştır.
Amniyosentez Protokolü
Amniyon örneklerini almak riskli olduğu için çalışılan kültürde kontaminasyon veya enfeksiyon olma durumuna karşın çalışmalar en az iki ayrı flaskta, idealde üç ayrı flaskta ve en az iki ayrı kültür ortamında paralel yapılmaktadır. Paralel çalışma için farklı lot numaralı aynı medyum ya da farklı medyumlar kullanılabilir ancak kesinlikle farklı etüvlerde çalışılmalıdır.
Alınan amniyon örneği steril koşullar altında iki veya üç farklı flask içerisindeki yaklaşık 3-5 cc medyuma ekilir.
Farklı etüvlerdeki flasklarda CO2’li etüvde hücrelerin gelişmesi beklenir.
İlk 24 saatte enfeksiyon açısından kültürler kontrol edilir.
Kolonizasyon takibi yapılır ve taze medyum eklenir.
Yeterli kolonizasyon görüldüğü zaman (yaklaşık 10. ± 2 gün) kültür Colsemid ile sonlandırılır.
Sonlandırılan kültürü tüplere boşaltmak için hücrelerin yapıştığı yüzeyden Tripsin EDTA solüsyonu ile kaldırılmaları gerekir.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve Giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç verilir.
Tüm Bio Amf çeşitlerini benzer protokolle çalışılabilir ancak amniyosentez çalışmasının aşamaları, kullanılan kimyasal miktarları ve süreler laboratuara ve çalışan kişiye göre faklılıklar gösterebilir. Bu nedenle genel olarak amniyosentez protokolünün aşamaları verilmekle birlikte ayrıntılar belirtilmemiştir. Ayrıntılı bilgi research@drzeydanli.com.tr adresine mail atabilirsiniz.
CVS’DE (CHORION VILLUS SAMPLE) KROMOZOM ANALİZİ PROTOKOLÜ
Koryon villüs biyopsisi (CVS) trofoblastik dokudan direkt ve indirekt (kültür ortamı hazırlanıp), kromozom analizi yapılması işlemidir. Trofoblastik doku kendi kendine replike olabilen bir dokudur (Şekil 3). Bu nedenle direkt olarak kromozom eldesi için uygundur. CVS’de anne hücreleri ile kontamine olma olasılığı yüksek olduğu için (%12-14), uzun dönem doku kültürünün yanısıra mutlaka direkt çalışma yapılmalıdır. Direkt çalışmada kromozom eldesi zor olduğundan ve kromozom kalitesi düşük olduğu için, direkt preperasyonla metafaz ve interfaz hücrelerine FISH (Floresan in situ hibridizasyon) tekniği uygulanabilir. Bunu mutlaka uzun dönem doku kültürü ile doğrulamak gerekmektedir.
CVS ne zaman yapılır?
Bu işlem gebeliğin 9.-12. haftaları arasında yapılabilir.
CVS işleminin riski nedir?
Fetal kayıp oranı %1.7-4.6’dır. Anne hücreleri ile kontamine olma olasılığı %12-14’dür. CVS’de belirlenen anomalinin ikinci bir prenatal tanı tekniği ile (gebelik haftası ile uyumlu olarak örneğin amniyosentez veya kordosentez materyali) doğrulanması tercih edilebilir. Eğer hastanın raporu direkt çalışma, indirekt kültür ve FISH tekniği birlikte kullanılarak hazırlanmışsa tanı daha güvenilir olacaktır.
Kullanılacak Malzemeler:
Ham’s F10 (Bio. Ind, 01-090-1)
Bio Amf 2 (Bio. Ind,01-194-1)
Colsemid (Bio. Ind,12-004-1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Sodyum Sitrat (Serva, 38642)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Petriler (Corning, 430165, 430166, 430167)
Flask (Corning, 430168)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Alınan CVS örnekleri iki farklı yöntemle çalışılır.
Direkt Kültür
Uzun Süreli Kültür
Medyum Özelliği:
Bio Amf 2 medyumu eritildikten sonra direkt kullanılır. Amniyosentez aşamasında gerekli olan PHA-M ekleme işlemi CVS de yapılmaz.
DİREK KÜLTÜR
Tüpün içindeki CVS örneği petri üzerinde parçalara ayrılarak iki 35 mm petri üzerine konur.
Üzerine yaklaşık 2 cc Bio Amf 2 konulur ve 37 0C lik etüvde bekletilir.
24 saat sonra 20-25 damla colsemid eklenir ve kültür sonlandırılır.
Colsemid ile birlikte 1 saat 37 0C de bekletilir.
Sonra hipotonik aşaması gerçekleştirilir. Hipotonik olarak KCL yerine sodyum sitrat çözeltisi kullanılır.
Hipotonik aşamasından sonra fiksatif aşamasına geçilir. Direk kültürde fiksasyon standart prosedürlerden biraz farklıdır. Ayrıntılı bilgi için research@drzeydanli.com.tr adresine mail atabilirsiniz.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç verilir.
UZUN SÜRELİ KÜLTÜR
100 mm’lik petri içinde kesilen CVS parçalarından birisi 65 mm’lik petriye alınır.
Üzerine birkaç damla Bio Amf 2 konulur ve pens ile daha küçük parçalara ayrılır.
Parçalanan hücrelerin üzerine yaklaşık 3 cc Bio Amf 2 daha eklenir ve pipet ile flaska boşaltılır.
Kültür her sabah kontrol edilir ve 7. günde medyumu tazelenir.
1-2 hafta kültür sonrasında üremenin yeterli olduğu düşünülünce kültür sonlandırılmasına geçilir.
Sonlandırılan kültürü tüplere boşaltmak için hücrelerin yapıştığı yüzeyden Tripsin EDTA solüsyonu ile kaldırılmaları gerekir.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve Giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç verilir.
POSTNATAL TANI PROTOKOLLERİ
PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZ PROTOKOLÜ
Periferik kandan elde edilen kromozomlar, bireye ait kromozom hastalıklarının tanısında kullanılmaktadır.
Periferik kandan kromozom analizi hangi durumlarda kullanılır?
> Dismorfizm
> Konjenital anomaliler
> Büyüme ve gelişme geriliği
> Mental retardasyon
> İnfertilite
> Tekrarlayan düşükler ve kötü obstetrik öykü
> Amenore
> Ailede dengeli kromozomal değişim olması
Kullanılacak Malzemeler:
RPMI 1640 Medyum (Bio. Ind., 01-106-1 ), Peripheral Blood Karyotyping Medium with PHA-M (Bio. Ind., 01-201-1) ya da Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M (Bio. Ind., 01-198-1) medyumlarından herhangi bir tanesi
Fetal Calf Serum (Bio. Ind., 04-007-1) – RPMI için
Penisilin/streptomisin solüsyonu (Bio. Ind., 03-031-1) – RPMI için
L-Glutamin(Biological Industries, 03-020-1) RPMI -için
PHA-M (Fitohemaglutinin M) (Bio. Ind.,12-006-1) RPMI ve Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M için
Kolsemid solüsyonu (Bio. Ind., 12-004-1)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
PBS 1 X (Dr.Zeydanlı, DZPBS1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Medyum Özelliği:
RPMI kullanılacaksa;
RPMI’nın 100 ml’sine
20 ml Fetal Calf Serum,
2 ml L-Glutamin,
1-2 ml Penisilin/streptomisin,
1,5 ml de PHA-M
Fetal Calf Serum (Bio. Ind., 04-007-1) – RPMI için
Penisilin/streptomisin solüsyonu (Bio. Ind., 03-031-1) – RPMI için
L-Glutamin(Biological Industries, 03-020-1) RPMI -için
PHA-M (Fitohemaglutinin M) (Bio. Ind.,12-006-1) RPMI ve Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M için
Kolsemid solüsyonu (Bio. Ind., 12-004-1)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
PBS 1 X (Dr.Zeydanlı, DZPBS1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Medyum Özelliği:
RPMI kullanılacaksa;
RPMI’nın 100 ml’sine
20 ml Fetal Calf Serum,
2 ml L-Glutamin,
1-2 ml Penisilin/streptomisin,
1,5 ml de PHA-M
konulmalıdır. Böylece RPMI kullanıma hazır hale getirilir.
Peripheral Blood Karyotyping Medium with PHA-M kullanılacaksa;
Peripheral Blood Karyotyping Medium with PHA-M kullanılacaksa;
Medyum kullanıma hazırdır. Eritilip kullanılabilir.
Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M kullanılacaksa;
Peripheral Blood Karyotyping Medium w/o PHA-M kullanılacaksa;
Medyum eritildikten sonra içerisine 2-4 cc PHAM eklenerek kullanıma hazır hale getirilebilir.
Hangi medyumun kullanılacağı laboratuar koşullarında gerekli optimize çalışmalarından sonra araştırıcı tarafından belirlenmelidir.
Periferik kan protokolü:
Hangi medyumun kullanılacağı laboratuar koşullarında gerekli optimize çalışmalarından sonra araştırıcı tarafından belirlenmelidir.
Periferik kan protokolü:
Kan örnekleri kültür tüpünün içinde bulunan yaklaşık 5 cc medyuma ekilir.
72 saat boyunca etüvde 37 0C’de inkübasyona bırakılır.
72. saatte tüplere 2 damla colsemid eklenir ve hücreler metafaz aşamasında durdurulur.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç verilir
KEMİK İLİĞİNDE KROMOZOM ANALİZ PROTOKOLÜ
72 saat boyunca etüvde 37 0C’de inkübasyona bırakılır.
72. saatte tüplere 2 damla colsemid eklenir ve hücreler metafaz aşamasında durdurulur.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç verilir
KEMİK İLİĞİNDE KROMOZOM ANALİZ PROTOKOLÜ
Kemik iliğinden kromozom analizi hangi durumlarda kullanılır?
Kan kanserleri çoğunlukla kromozomal mutasyonlarla oluşmaktadır. Akut lenfositik lösemi (ALL), Kronik lenfositik lösemi (KLL), Akut myeloid lösemi (AML) ve Kronik Myeloid Lösemi (KML) tipi kan kanseri vakalarında periferik kan, kültürde üremeye yetecek kalitede de olmayabilir. Bu nedenle kemik iliğinden elde edilen kromozomlara bakılarak kanserin genetik yönü tayin edilebilir. Bu nedenle bu rahatsızlıkların genetiği çok önemlidir.
Kullanılacak Malzemeler:
Kullanılacak Malzemeler:
Bone Marrow Karyotyping Medium (Bio. Ind., 01-199-1) ya da hematopoietic Cell Karyotyping Medium (Bio. Ind., 01-200-1)
Kolsemid solüsyonu (Bio. Ind., 12-004-1)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
PBS 1 X (Dr.Zeydanlı, DZPBS1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Medyum Özelliği:
Kolsemid solüsyonu (Bio. Ind., 12-004-1)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
PBS 1 X (Dr.Zeydanlı, DZPBS1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Medyum Özelliği:
Her iki medyumda kullanıma hazır medyumlardır. Yukarıda belirtilen özellikte eritildikten sonra direk kullanılabilir.
Hangi medyumun kullanılacağı laboratuar koşullarında gerekli optimize çalışmalarından sonra araştırıcı
tarafından belirlenmelidir.
Kemik iliği protokolü:
Hangi medyumun kullanılacağı laboratuar koşullarında gerekli optimize çalışmalarından sonra araştırıcı
tarafından belirlenmelidir.
Kemik iliği protokolü:
Kemik iliği örnekleri kültür tüpünün içinde bulunan yaklaşık 5 cc medyuma ekilir.
24 saat boyunca etüvde 37 0C’de inkübasyona bırakılır.
24. saatte tüplere 2 damla colsemid eklenir ve hücreler mitoz aşamasında durdurulur.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve Giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç veririr.
Kemik iliği kromozomları, normal hücrelerden elde edilen kromozomlara kıyasla daha kısa ve şişman bir görünüme sahiptir.
24 saat boyunca etüvde 37 0C’de inkübasyona bırakılır.
24. saatte tüplere 2 damla colsemid eklenir ve hücreler mitoz aşamasında durdurulur.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve Giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç veririr.
Kemik iliği kromozomları, normal hücrelerden elde edilen kromozomlara kıyasla daha kısa ve şişman bir görünüme sahiptir.
POSTMORTEM TANI PROTOKOLLERİ
FİBROBLAST MATERYALİ (CİLT DOKU) KROMOZOM ANALİZ PROTOKOLÜ
Ölmüş vakalarda ölüm nedenini anlamak için kromozom analizi yapılmak istendiğinde kullanılabilecek en uygun materyal cilt dokudur. Kolun iç kısmından birkaç mm’lik derinlikten alınan küçük bir parça doku örneği belirli protokollerden geçirilerek kromozom analizi yapılabilir.
Kullanılacak Malzemeler:
Bio Amf 1 (Bio. Ind,01-190-1 ve 01-192-1)
Colsemid (Bio. Ind,12-004-1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
PBS 1X Solüsyon Ca ve Mg içermez (Dr. Zeydanlı, DZPBS1-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Flask (Corning, 430168)
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Colsemid (Bio. Ind,12-004-1)
Tripsin EDTA Solüsyon C (Bio. Ind., 03-053-1)
PBS 1X Solüsyon Ca ve Mg içermez (Dr. Zeydanlı, DZPBS1-1)
KCl 0.075 M solüsyon (Dr. Zeydanlı, DZKCL-1)
Na2HPO4.2H2O (Serva, 30200)
NaH2PO4.H2O (Amresco, 0823)
Giemsa
Metanol
Asetik asit
Flask (Corning, 430168)
Kültür Tüpü (Corning 430766, Grainer 164160)
Disposable Pipetler (Corning, 4487, 4488, 4489)
Pipetaid (Boeco, 9500000)
Pastör Pipeti
Lam
Cilt Doku Protokolü:
Alınan doku örneği steril koşullar altında petri üzerinde önce biraz medyumla yıkanır. Medyum boşaltılır ve cilt örnekler bisturi ile küçük parçalara ayrılır. Sonra yaklaşık 2 cc medyum eklenir, karıştırılır ve enjektör ile yaklaşık 1 cc si flaska püskürtülür. Püskürtme sayesinde doku parçalarının flask yüzeyine tutunması kolay hale getirilir. Bir iki kez çalkalanarak doku parçalarının flaska iyice yayılması sağlanır.
Flask içerisindeki medyum uzaklaştırılarak kuru ortamda dokular yaklaşık 24 saat bekletilir.
Kuruma işleminden sonra yaklaşık 2,5 cc medyum eklenir.
Farklı etüvlerdeki flasklarda CO2’li etüvde hücrelerin gelişmesi beklenir.
İlk 24 saatte enfeksiyon açısından kültürler kontrol edilir.
Kolonizasyon takibi yapılır ve taze medyum eklenir.
Yeterli kolonizasyon görüldüğü zaman (yaklaşık 10. ± 2 gün) kültür Colsemid ile sonlandırılır.
Sonlandırılan kültürü tüplere boşaltmak için hücrelerin yapıştığı yüzeyden Tripsin EDTA solüsyonu ile kaldırılmaları gerekir.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve Giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç verilir.
Flask içerisindeki medyum uzaklaştırılarak kuru ortamda dokular yaklaşık 24 saat bekletilir.
Kuruma işleminden sonra yaklaşık 2,5 cc medyum eklenir.
Farklı etüvlerdeki flasklarda CO2’li etüvde hücrelerin gelişmesi beklenir.
İlk 24 saatte enfeksiyon açısından kültürler kontrol edilir.
Kolonizasyon takibi yapılır ve taze medyum eklenir.
Yeterli kolonizasyon görüldüğü zaman (yaklaşık 10. ± 2 gün) kültür Colsemid ile sonlandırılır.
Sonlandırılan kültürü tüplere boşaltmak için hücrelerin yapıştığı yüzeyden Tripsin EDTA solüsyonu ile kaldırılmaları gerekir.
Hipotonik ile hücreler patlatılır ve fiksasyon ile yıkama işlemi yapılır.
Hücreler lam üzerine yayılarak metafaz plakları elde edilir.
Yaklaşık 24 saat kurutularak boyamaya hazır hale getirilir.
Tripsin ve Giemsa ile kromozomlar boyanarak metafaz plakları görünür hale gelir.
Boyamadan sonra kısa bir süre kurutma yapılır.
Mikroskopta incelenerek ve görüntülemede analiz yapılarak hastaya sonuç verilir.
Şekiller.
NOT: Yukarıda anlatılan tüm protokoller laboratuar koşullarına göre farklılıklar gösterebilir. Ayrıntılı bilgi için research@drzeydanli.com.tr adresine mail atabilirsiniz.