|
|
Moleküler Genetik
GİRİŞ
Moleküler genetik, canlıların kalıtım materyali olan genlerin yapılarını ve işlevlerini moleküler düzeyde inceleyen bir bilim dalıdır. Moleküler genetik alanında sağlanan gelişmeler sayesinde günümüzde bir çok hastalığın temelinde yatan mekanizmalar belirlenmiş, bu hastalıkların tanı ve tedavisine yönelik yöntemler geliştirilmiştir. Kalıtsal hastalıklar bireylerin gen yapılarında meydana gelen kalıcı değişiklikler sonucu oluşurlar ve kalıtım yolu ile anne-babadan çocuklara aktarılabilmektedirler. Kalıtsal hastalıklar içerisinde yer alan tek gen hastalıkları başta olmak üzere birçok hastalığın tanısı moleküler genetik yöntemler kullanılarak yapılabilmektedir.
MOLEKÜLER GENETİK ANALİZ PROTOKOLLERİ
Genetik çalışmalarda kullanılacak başlangıç materyali ve yöntem, çalışmanın amacına ve kapsamına bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Genetik hastalıkların tanısında en sık olarak kullanılan başlangıç materyali serum ve kan olmakla birlikte doku, parafine gömülü doku, lökosit, tükürük, sürüntü ve gaitada başlangıç materyali olarak kullanılabilmektedir.
Moleküler genetik alanında kalıtsal mutasyonların tespiti amacı ile kullanılan ve aşağıda belirtilen temel bazı yöntemler ilerleyen bölümlerde açıklanacaktır.
> PCR (Polymerase Chain Reaction)
> ASO-PCR (Allel Spesific Oligonucleotide)
> RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
MOLEKÜLER GENETİK ALANINDA KULLANILAN SARF, PLASTİK MALZEME VE CİHAZLAR
Dr. Zeydanlı markası bünyesinde moleküler genetik alanında kullanılan birçok solüsyonu bulabilirsiniz, ayrıca tek gen mutasyonları ve delesyonların tespitine yönelik mutasyon analiz kitleri ile Dr. Zeydanlı bu alanda Türkiye’nin ilk yerli markası olma özelliğini taşımaktadır. Tüm ürünlerimiz CE belgelidir.
Firmamız moleküler genetik alanında “üretici” olarak dünya piyasasında yer alan birçok firmanın temsilciliğini yürütmektedir. Temel moleküler genetik yöntemlerinde kullanılan çeşitli sarf, plastik malzeme ve cihazların listesi aşağıda belirtilmektedir. Liste PCR çalışması baz alınarak hazırlanmış, takip eden yöntemlerde gerekli ek malzemeler belirtilmiştir.
Kullanılacak malzemeler ve cihazlar:
DNA İzolasyon;
DZ İzolasyon Kiti (Dr. Zeydanlı DZDNA)(Solüsyon bazlı)
Kandan DNA İzolasyon Kiti (Omega 3392)(Spin kolon)
Etanol Absolute (Merck)
Isı Bloğu (Boeco 8083000)
Isıtıcılı Magnetik Karıştırıcı (Boeco 8054000)
Vorteks (Boeco 8055000)
Combi-Spin (Boeco 8071000)
Soğutmalı Mikrosantrifüj M-240R (Boeco 02405–13)
Mikrosantrifüj M–240 (Boeco 02400–13)
pH Metre (Boeco 5196000)
Spektrofotometre (Boeco 8636001)
PCR/ASO-PCR;
Taq DNA Polymerase (Bioron 101005)
Super Hot Taq DNA Polymerase (Bioron 119002)
dNTP Set (dTTP.dATP, dCTP, dGTP) (Larova 0100)
Ultra Saf Su (Dr. Zeydanlı DZWTR–05)
Primer 200nmol HP Salt Free (MWG)
PCR Cihazı (Peqlab)
Mikropipet ucu 1- 200 µl sarı (Corning 4845)
Mikropipet ucu 100–1000 µl mavi (Corning 4846)
Mikropipet ucu 1–10µl (Corning 4840)
Pipet ucu filtreli 0,5–10 μl (Corning 4807)
Pipet ucu filtreli 1–30 μl (Corning 4821)
Pipet ucu filtreli 1–200 μl (Corning 4823)
Pipet ucu filtreli 100–1000 μl (Corning 4809)
Eppendorf tüp 1,5 ml (Corning 3622)
PCR tüp 0,5 ml (Corning 3749)
PCR tüp 0,2 ml (Corning 3745)
0,2 μl freezing rack, 32 mikrotüp (-20ºC)
0,2 μl PCR tüp Rack (Dr. Zeydanlı DZ002)
Karton kutu 100’lük (Dr. Zeydanlı DZ001)
0,5–10 µl'lik Oto. Pipet (Otoklavlanabilir)(Boeco 9410010)
2–20 µl'lik Oto. Pipet (Otoklavlanabilir)(Boeco 9410020)
20–200 µl 'lik Oto. Pipet (Otoklavlanabilir)(Boeco 9410220)
100–1000 µl'lik Oto. Pipet (Otoklavlanabilir)(Boeco 9411100)
PCR Çalışma Kabini (Boeco 8040000)
RFLP;
Restriksiyon enzimleri (Bioron)
Elektroforez;
Agaroz (Peqlab 35–1010)
6X Loading Buffer (Dr. Zeydanlı DZLB6X–5, DZBFB–5)
Molecular Weight Marker DNA 100BP (Bioron 306005)
Ethidium Bromide 10 mg/ml stock solution (Dr. Zeydanlı DZEB–5)
TAE/TBE Buffer (Dr. Zeydanlı)
Yatay Elektroforez Mini (CSL)
Yatay Elektroforez Midi (CSL)
Jel Görüntüleme Sistemi (Syngene)
Güç Kaynağı (CSL, MP–300)
Mikrodalga Fırın
5’ Nukleaz PCR;
Prob (MWG)
0,2 µl 8’li strip tüp ve optik kapak (Corning 3741, 3742)
Real-Time PCR
DNA İzolasyon
DZ DNA İzolasyon Kiti (Dr. Zeydanlı DZDNA)
Geliştirdiğimiz DZ DNA İzolasyon Kiti ile 250 µl örnekten hızlı ve kolay bir şekilde bakteri, virüs ya da genomik DNA izolasyonu yapılabilmektedir. Bu metot ile serumdan, kandan, lökositten, tükürükten, parafine gömülü doku örneklerinden, sürüntüden ve gaitadan DNA izolasyonu yapılabilir. Dr. Zeydanlı DNA İzolasyon Kiti (DZDNA) ile izolasyon işlemi ortalama 90 dk sürmektedir. Kit, fenol/kloroform yöntemine dayalıdır.
Kandan DNA İzolasyon Kiti (Omega 3392)
Spin kolon temelli izolasyon yönteminin tercih edildiği durumlarda OMEGA firmasının ürettiği birçok farklı kaynaktan DNA ve RNA eldesine imkan veren kitlerden yararlanılabilmektedir.
Isıtıcı Blok (Boeco Kat No: 8083000)
Farklı sıcaklıklarda uzun süreli inkübasyon işlemleri için tasarlanmış, kolay kullanımlı bir kuru ısıtıcı bloktur. Dijital ekranı anlık sıcaklık ve zaman izlenmesine imkân vermektedir. Aynı anda 24 adet 1.5/2 ml, 15 adet 0,5 ml ve 10 adet 0,2 ml tüp ile çalışılabilmektedir.
Vorteks (Boeco Kat No: 8055000)
BOECO firması ürünleri arasında yer alan vorteks karıştırıcının hız ayarı cihaz üzerinde bulunan bir düğme yardımı ile değiştirilebilmektedir. Cihazın sürekli çalışma seçeneğinin yanında baskı ile çalıştırılma seçeneği de mevcuttur. 1,5 ml’ den 50 ml’ ye kadar tüpler için uygun ve 300–3000 rpm hız aralığına sahiptir.
Combi-Spin (Boeco Kat No: 8071000)
Mikro test tüpleri için hazırlanan bu santrifüj, vorteks karıştırıcı kombinasyonu genetik mühendislik araştırmaları özellikle de PCR-tanı deneyleri için tasarlanmıştır. Devamlı olarak en fazla 60 dakika çalışma süresi, 2400 rpm hızı vardır. 12 adet 1,5 ml’lik tüp için bir rotor ve yine 12 adet 0,5 ml ve 0,2 ml’lik tüp için de bir rotoru vardır.
Soğutmalı ve Soğutmasız Mikrosantrifüj (Boeco Kat No: 02400–13 (M240), 02405–13(M-240R))
M–240 ve M-240R santrifüj modelleri sınıflarının en hızlı santrifüjleridir. Otoklavlanabilen ve hava geçirmez aksesuarları ile bulaşıcı materyallerin bile kullanıcı ve çevre açısından güvenli şekilde çalışılmasına imkân vermektedir. CE, IEC1010–2–2 ve DIN düzenlemelerine uygun olarak ISO standartlarında cihazlardır. Masaüstü kullanıma uygundur, 14.000rpm veya 18.626g hızda çalışılabilmektedir.
Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı (Boeco Kat No: 8054000)
Solvent ve kimyasal maddelere dayanıklı seramik yüzeye ve 60–1110 rpm arasında ayarlanabilen hız kontrolüne sahiptir. Hem karıştırma hem de ısıtma özelliği mevcuttur, sıcaklık 20–450° C arasında ayarlanabilmekte ve 550º C üzerinde ışıklı ikaz vererek, ısıtmayı durdurmaktadır. 15 litre karıştırma ve ısıtma kapasitesi ile 750 watt ısıtma gücüne sahiptir.
pH Metre (Boeco Kat No: 5196000)
Laboratuar kullanımı için uygun, paralel sıcaklık ve fonksiyon mod belirtecine sahip bir modeldir.
Spektrofotometre (Boeco Kat No: 8636001)
Öncelikli alanı DNA ve protein olan çalışmalar için tasarlanmış, önceden hazırlanmış DNA ve protein analiz programlarına sahiptir. Özel küvet ve küvet tutucular kullanılarak 50 µl kadar örnek kullanılarak 70 ng gibi küçük miktarlarda DNA ölçümü yapabilecek şekilde optimize edilmiştir. 260/280nm ya da 260/230nm’de saflık oranını otomatik olarak ölçmektedir.
PCR/ASO-PCR
Taq DNA Polimeraz/ Super Hot Taq DNA Polimeraz (Bioron 101005, 119002)
Taq DNA Polimeraz, Thermus aquaticus YT–1(1)’den izole edilmiş ısıya dayanıklı bir enzimdir. 5u/µl konsantrasyona sahiptir, DNA’yı 72°C’de çoğaltma özelliğindedir. Enzim ortamda magnezyum iyonlarının varlığında 5’-3’ yönünde aktivite göstermektedir, ayrıca 5’-3’ ekzonukleaz aktivitesine de sahiptir.
Super Hot Taq DNA Polimeraz, Taq DNA Polimeraz ve Anti-Taq DNA polimeraz monoklonal antibodilerinin optimize karışımından meydana gelmektedir. Antibodiler, PCR reaksiyonun hazırlanması sırasında oda sıcaklığında (20-22oC) Taq’ın aktivitesini engeller. Sıcaklık 70 oC’nin üzerine çıktığında bu engelleme ortadan kalkar, ve Taq aktivite göstermeye başlar. Bu nedenle Super Hot Taq DNA polimeraz ile daha kaliteli, unspesifik PCR ürünleri ve primer-dimerlerinden uzak PCR ürünleri elde edilebilmektedir.
Farklı kullanım amaçlarına yönelik Taq DNA polimerazlar hakkında daha fazla bilgiyi www.bioron.net linkinden bulabilirsiniz.
dNTP Set (dTTP, dATP, dCTP, dGTP) (Larova 0200, 0100)
Deoksinükleotid trifosfatlar (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) ayrı ayrı set veya karışım olarak bulunabilmektedirler.
LAROVA firmasından elde ettiğimiz dNTP’ler, kullanıcının tercihine bağlı olarak 10 mM’lık dNTP karışım veya 100 mM’lık dATP, dGTP, dTTP ve dCTP seti olarak bulunmaktadır.
Ultra Saf Su (Dr. Zeydanlı Kat No: DZWTR–05, DZWTR–1)
PCR kullanımına uygun, DNaz ve RNaz’dan arındırılmıştır.
Primer (MWG)
PCR yöntemi ile çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı özellikte bir çift sentetik oligonükleotid dizisi primer olarak adlandırılır. Her bir dizi genel olarak 18-25 baz uzunluğundadır.
PCR Cihazı (Peqlab)
PEQLAB markasına ait farklı kullanım amaçlarına uygun PCR cihazları mevcuttur.
Filtreli ve Filtresiz Mikropipet Ucu 1–10µl, 1–200µl, 100–1000µl (Corning)
CORNING bünyesinde farklı ambalaj şekillerinde, filtreli-filtresiz, steril ve non-steril uçlar bulunmaktadır. Non-pyrojenik sertifikalı olan bu pipet uçları DNase/RNase’dan arındırılmış ve birçok farklı pipetle uyumludurlar.
Eppendorf ve PCR Tüpleri (Corning)
DNase/RNase ’dan arındırılmış, non-sterile ve otoklavlanabilir özelliktedirler. 17.000xg’ye dayanıklı ve yassı kapaklıdır. CORNING PCR tüplerinin tercih edilmesinin sebebi, “Thermowell” teknolojisi ile üretilen bu tüpler sıvının kolay akışını sağlayan iç yüzeye ve ince duvara sahiptir.
Karton Kutu (Dr. Zeydanlı DZ001)
1,5 ml mikrosantrifüj tüplerine uygun, 10x10 tüp kapasiteli ve -20ºC’ye dayanıklı karton kutulardır. DNA saklama amacı ile kullanıma uygundur.
Otoklavlanabilir Mikropipet (Boeco Kat No: 9410010, 9410020, 9410220, 9411100)
Tüm pipet aksamı 20dk 121ºC’ de otoklavlanabilmektedir. Pipet üzerinde ayarlanan hacmin izlenebildiği bir gösterge bulunmaktadır. Piston mekanizması çevrilerek istenilen hacim kolaylıkla ayarlanabilmekte ve ayarlanan hacmin değişmesini engelleyen bir kilit mekanizması bulunmaktadır.
PCR Çalışma Kabini (Boeco Kat No: 8040000)
PCR reaksiyonunun hazırlanması ve diğer moleküler biyoloji yöntemleri için kontaminasyondan arındırılmış bir ortama ihtiyaç duyulmaktadır. UVC/T-AR PCR çalışma kabini laboratuar çalışma alanında DNA/RNA dekontaminasyonu için tasarlanmıştır.
RFLP
Restriksiyon Enzimleri (Bioron)
BIORON firmasına ait restriksiyon enzimleri içerisinde 70 den fazla çeşit vardır ve bu enzimler alternatifli ambalajları ile kullanıcıya sunulmaktadır.
Elektroforez
Agaroz (Peqlab, 35-1010)
Agaroz jel elektroforezinde kullanılan agaroz konsantrasyonu %0,5–1,5 arasında değiştirilerek jelin por çapı belirlenebilir. Bu şekilde hazırlanan yüksek konsantrasyonlu jeller ile küçük, düşük konsantrasyonlu jeller ile de büyük DNA fragmanlarının en uygun şekilde jelde yürütülmesi sağlanır. Rutin elektroforez çalışmaları için PEQLAB firmasından elde edilen agaroz kullanılabilmekle birlikte AMRESCO ve SERVA firması tarafından üretilen farklı kullanım amaçlarına yönelik birçok agaroz çeşidi mevcuttur. Detaylı bilgiyi firmalara ait ilgili bölümde bulabilirsiniz.
6X Jel Yükleme Solüsyonu (Dr. Zeydanlı DZLB6X–5, DZBFB–5)
Elektroforezin yürütülmesi aşamasında, örneklerin kuyuya oturma ve yürüme sırasında nerede olduklarının takip edilmesini sağlayan boyalar kullanılmaktadır. DR. ZEYDANLI markasının bu amaçla kullanılan Orange G ve Bromo fenol mavisi içeren iki farklı 6X Jel Yükleme Solüsyonu bulunmaktadır.
Moleküler Ağırlık Marker 100 bp (Bioron 306005)
Elektroforez sonucu elde edilen bantların uzunluklarının tespit edilebilmesi için uzunluğu bilinen standartlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu sebeple PCR sonucunda elde edilmesi beklenen bant uzunlukları ile karşılaştırma yapmaya uygun DNA markerların seçilmesi tavsiye edilmektedir. BIORON marka ürünleri arasında yer alan bu marker 100-1500 bp aralığında yer alan 100-200-300-400-500-600-700-800-900-1000 ve 1500 bp uzunluğunda ki bantları analiz imkanı vermektedir.
Ethidium Bromide 10 mg/ml (Dr. Zeydanlı DZEB–5)
EtBr jel içinde yürütülen DNA’nın görüntülenebilmesi amacı ile kullanılmaktadır. EtBr DNA bazları arasında girerek, ultraviyole ışık altında floresan ışık yaymaktadır. DR. ZEYDANLI marka ürünler arasında 10 mg/ml’lik stok solüsyon olarak bulunmaktadır, EtBr mutajen bir madde olduğu için bu işlemler sırasında EtBr içeren buharın solunmaması ve deriye temas etmemesi için gerekli önlem alınmalıdır.
TAE/TBE Solüsyonları (Dr. Zeydanlı)
Elektroforez tankının içine konulacak elektrolit sıvısı olarak genelde TAE (trisasetik-asit-EDTA) ve TBE (tris-borik asit-EDTA) solüsyonları kullanılmaktadır. Çalışma yapılırken elektroforez tankta bulunan solüsyon ile jel hazırlanırken kullanılan tamponun aynı olması gerekmektedir, genel olarak 0,5 veya 1X konsantrasyonda kullanılmaktadırlar. DR. ZEYDANLI marka ürünler arasında 1X, 5X, 10X TBE ve 1X, 5X, 10X, 50X TAE solüsyonları yer almaktadır.
Yatay Elektroforez ve Güç Kaynağı (CSL)
CSL, birçok farklı boyutta yatay ve dikey elektroforez sistemleri ve bu sistemlere uyumlu güç kaynakları üretmektedir. Tüm sistemler ve güç kaynakları için ayrıntılı bilgiye www.cleaverscientific.com adresinden ulaşabilirsiniz.
Jel Görüntüleme Sistemi (Syngene)
Farklı konfigürasyonlarda geniş bir ürün yelpazesine sahip Syngene firması, DNA Jel görüntüleme ve analizinden 2D Protein analizine kadar oldukça detaylı ürün grubuna sahiptir. Syngene marka jel görüntüleme sistemleri ile ilgili ayrıntılı bilgiye katalogun firma ile ilgili bölümü veya www.syngene.com adresinden ulaşabilirsiniz.
5’ Nukleaz PCR
Prob (MWG)
5’ nukleaz PCR çalışmalarında primerlere ek olarak 5’ ve 3’ yönü işaretli problara ihtiyaç duyulmaktadır. Yaklaşık 20 bazdan oluşan bu oligonükleotid dizilerinin bir ucunda FAM, HEX, JOE ve VIC gibi bir florasan boya diğer ucunda ise bir baskılayıcı bulunmaktadır.
0,2 µl 8’li Strip Tüp ve Optik Kapak (Corning 3741, 3742)
DNase/RNase ’dan arındırılmış, non-sterile ve otoklavlanabilir özelliktedirler. Real-time PCR cihazları ile kullanıma uygun optik kapakları ayrı olarak temin edilebilmektedir.
DNA İZOLASYON PROTOKOLÜ
DNA İzolasyonu hangi aşamalardan oluşmaktadır?
DNA izolasyonu temelde 2 aşamadan meydana gelir.
1. Hücre duvarının parçalanması
2. DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve diğer moleküllerden ayrılması
Hücre Duvarının Parçalanması: Hücrenin çekirdeğindeki DNA’ya ulaşmak için hücre duvarının parçalanması gerekmektedir. Parçalama fiziksel ve kimyasal yollarla yapılabilir. Fiziksel olarak ısıtılan hücreler aynı zamanda kimyasal karışımlara tabi tutularak duvarın parçalanması sağlanır. Bu kimyasal karışım içinde bulunan tuz, hücre duvarından geçerek proteinleri DNA’ dan ayırır. Deterjan ise hücre duvarının geçirgenliğini arttırarak hücre içeriğinin serbest kalmasını sağlar. EDTA magnezyumu bağlayarak DNaz aktivitesini inhibe eder böylece DNA stabil halde kalabilir. Protein parçalayıcı enzimler ise hücre içeriğindeki proteinleri parçalayarak, sonraki aşamalar açısından homojen bir karışım oluşmasını sağlamaktadırlar. Hücre içinde bulunan RNA’lar tek iplikçik halde stabil olabildiklerinden onların da ortamdan uzaklaştırılması gerekir ve bunun için de RNaz enzimi kullanılır.
Parçalama aşamasında kullanılan kimyasallar ve süre DNA’sını elde etmek istediğiniz materyale göre değişiklik gösterebilir. Örneğin, bazı bakterilerin DNA’sını elde ederken, farklı yapıdaki duvarı için lizozim adlı farklı bir enzim kullanılır ve süre daha uzun tutulabilir. Yine aynı şekilde kandan DNA izolasyonu için harcanan parçalama süresi, dokudan DNA izolasyonu için harcanan süreden daha azdır.
DNA-Protein Kompleksinin Çözülmesi ve Diğer Moleküllerden Ayrılması: Bu yöntem genellikle denatürasyona dayanır. Ancak günümüzde teknolojinin de gelişimi ile DNA’yı tutma özellikli spin kolonları da kullanılmaya başlamıştır. Denatürasyona dayalı kimyasal çözülmede çoğunlukla fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır. Fenol ile proteinler ve DNA fragmanları birbirinden ayrılır ve uzaklaşmaları sağlanır.
Spin kolonlarının kullandığı fiziksel çözülmede ise, özel solüsyonlar ile DNA’nın tüpler içine özel olarak yerleştirilen matriks tabakasına tutunması sağlanır. Aynı aşamada DNA haricindeki moleküller matrikse tutunamadığı için ortamdan uzaklaşır. Spin kolonlar belirli solüsyonlar ile yine DNA harici maddelerin tamamen uzaklaşması için “yıkama” denilen işleme tabi tutulurlar. Son aşamada ise DNA ile matriksi birbirinden elimine eden solüsyonların kullanıldığı “Elüsyon” aşaması vardır ve bu aşama ile birlikte DNA son halini almaktadır.
Elde edilen DNA’nın saflık ve miktar belirlenmesi nasıl yapılmaktadır?
PCR aşamasında elde edilen DNA’dan reaksiyon başına yaklaşık olarak 40–100 ng kullanılır. DNA konsantrasyonu ve elde edilen DNA’nın temizliği spektrofotometre kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla 260/280 absorbans değerlerinin ölçülebildiği bir UV spektrofotometreye ihtiyaç duyulmaktadır.
DNA' nın miktar ve saflığı, spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boylarında elde edilen değerlerden belirlenmektedir. Optik dansite (OD) çift iplikli DNA için 50 μg/ml, tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/ml ve oligonükleotidler için 20 μg/ml' ye karşılık gelmektedir. Örnek olarak çift iplikçikli DNA için miktar tayininde aşağıdaki formülden yararlanılmaktadır;
DNA (μg/ml)=260 nm'deki OD (Absorbans değeri) x sulandırma oranı x 50
DNA’nın temizliği için A (260 /280) ve A (260 /230) değerlerine bakılmaktadır. Çünkü DNA 260, protein 280 ve karbonhidratlar da 230 nm dalga boylarında pik (en yüksek değer) yapmaktadır. Temiz bir DNA’ da A (260 /280) oranı 1.80 ile 2.00 arasında; A (260 /23 0) oranı ise 2.00 den büyük; A (320) ise 0’ a yakın olmalıdır. 1.8’in altında elde edilen A (260 /280) değeri protein kontaminasyonunu, 2’nin üzerinde elde edilen A (260/280) değeri de RNA kontaminasyonunu işaret etmektedir. PCR yönteminde ne kadar saf ve yüksek molekül ağırlıklı DNA izole edilebilirse bantların belirginliği ve üretilebilirliği o derece artmaktadır.
Dr. Zeydanlı DNA İzolasyon yöntemi hangi aşamalardan oluşmaktadır?
DZ DNA İzolasyon Kiti, fenol/kloroform yöntemine dayalı bir kittir. Parçalayıcı enzim ile inkübasyon sonrasında fenol/kloroform ile bir araya getirilen DNA molekülleri, alkol ile proteinlerden ayrıştırılarak DNA eldesi tamamlanır.
Dr. Zeydanlı DNA İzolasyon yöntemi ile hangi materyallerden DNA elde edilebilir?
Bu metot ile serumdan, kandan, lökositten, tükürükten, parafine gömülü doku örneklerinden, sürüntüden ve gaitadan DNA izolasyonu yapılabilir. Farklı örneklerden izolasyon aşamaları aşağıda gibidir;
Serumdan DNA İzolasyonu;
1,5 ml nükleaz free tüp içine 500 µl Sol B, 25 µl Sol A ve 250 µl serum koyulur. Vortekslenir ve 42 °C ‘de 1 saat inkübe edilir.
Tüpler üzerine 500 µl Sol C koyulur (Sol C, iki fazlı bir solüsyondur. Alt fazından alınması gerekmektedir). Vortekslenir (Süt renginde bir sıvı oluşması beklenir) 10.000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir.
Oluşan 2 fazdan, üst kısımdaki berrak faz alınarak (~500 µl) temiz bir 1,5 ml nükleaz free tüpe koyulur. Üzerine 500 µl Sol D koyulur. Hafifçe vortekslenerek 10.000 rpm’de 10 dk santrifüj edilir.
Süpernatant atılır ve üzerine 500 µl Sol E koyulur. 10.000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir.
Süpernatant atılır. Tüpler 37 °C etüv veya kuru ısıtıcılı blok yardımı ile kurutulur. Kuruduktan sonra 50 µl distile su ile sulandırılır ve serum içerisindeki mikroorganizma DNA’sı elde edilmiş olur.
Parafine Gömülü Dokudan DNA İzolasyonu;
0,2 µm kesitler alınmış örneklerden leblebi büyüklüğünde 1,5 ml nükleaz free tüpe alınır.
Üzerine 1 ml Ksilen eklenir. Tüp hafifçe alt üst edilerek parafinin çözülmesi sağlanır. Bu şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika beklenir. Doku, 5000 rpm’de 1 dk santrifüj edilerek çöktürülür ve süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
Pelet üzerine tekrar 500µl Ksilen eklenir ve tüp alt üst edilerek yine santrifüj yapılır parafin iyice temizlenir. Süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
Pelet üzerine Ksilen’ i uzaklaştırmak için 1 ml % 99’luk alkol koyulur ve alt üst edilerek karıştırılır, 5000 rpm’ de 1 dk santrifüj edilerek doku çöktürülür. Süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
İkinci yıkama 750 µl % 75’lik alkolle ve 3. yıkama işlemi ise 750 µl dH2O ile yapılır. Her defasında tüp hafifçe çalkalanır, çöktürülür ve süpernatant uzaklaştırılır.
Bu işlemle doku parafinden arındırılmış olur.
Elde edilen örnek ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.
Tükürükten DNA İzolasyonu;
Tükürük örnekleri bir 50 ml tüp içerisindeki ~1ml Sol B içerisine alınır. Sol B içerisinde 6 ay oda sıcaklığında saklanabilir.
Solüsyon içerisindeki tükürük örneği ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.
Gaitadan DNA İzolasyonu;
Mercimek büyüklüğündeki gaita örneği 1,5 ml tüp içerisine alınır. Üzerine 750 µl kadar Nükleaz free steril su koyulur.
Yaklaşık 10 sn vortekslenerek 3000 rpm de 1 dk çevirilir.
Süpernatant (~750 µl) temiz bir 1,5 ml tüpe alınır ve bu şekli ile yıkama işlemi 3 kere tekrarlanır. Her defasında pelet atılır ve süpernatant üzerinden işlem yapılır.
En son alınan süpernatant (~500 µl) örneği ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.
Sürüntüden DNA İzolasyonu;
Sürüntü pamuk uçlu eküvyon ile alınmışsa;
1,5 ml tüp içine 500 µl Sol B koyulur. Eküvyonun örnek alınmış ucu tüp içine daldırılır ve 10 dk bekletilir.
Eküvyon alınır tüp içine Sol A eklenerek 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.
PCR nedir?
PCR, nükleik asitlerin in-vitro olarak (canlı organizma dışında), uygun koşullar altında çoğaltılmasına dayanmaktadır.
Hem araştırmada hem de klinik laboratuar tanısındaki uygulama alanlarıyla büyük öneme sahip olan PCR' ın geliştirilmesindeki çalışmaları nedeniyle, K. Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülünü almaya hak kazanmıştır.
PCR hangi basamaklardan oluşur?
PCR, istenilen sayıda tekrarlanabilen döngülerden oluşur. Bir PCR döngüsü sırasıyla, deoksiribonükleik asidin (DNA) iki zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılması (Denatürasyon-Denaturation); sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanması (Hibridizasyon-Annealing) ve zincirin yeni çift zincirli DNA'lar oluşturacak şekilde uzaması (Polimerizasyon-Extension) aşamalarından meydana gelir (Şekil 1).
Bu aşamaların her biri farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilir, sıcaklık aralıkları genel olarak;
>94°C-98°C Denatürasyon
>37°C-65°C Hibridizasyon (Annealing)
>72°C Polimerizasyon şeklindedir.
PCR tekniği, tek ve çift sarmallı DNA ya da RNA için kullanılabilir. PCR ile bir hedef DNA parçasından milyonlarca çoğaltmak mümkündür. Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı olan, 18-25 baz uzunluğunda bir çift sentetik oligonükleotid primer kullanılarak, bu iki primer ile sınırlandırılan bölgenin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır. PCR'ın önemli bir avantajı da çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamasıdır.
PCR bileşenleri nelerdir?
Bir PCR döngüsü için gerekli olan beş ana madde vardır: DNA örneği, bu genelde genomik DNA dır; çoğaltılacak bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer; deoksinükleotit trifosfatlar (dNTP); yüksek ısıya dayanıklı Taq DNA polimeraz enzimi; uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı ve MgCl2.
Moleküler genetik çalışmaları için birçok farklı kaynak materyalden farklı yöntemler kullanılarak DNA izole edilebilmektedir, PCR’ da kalıp görevi gören DNA’nın temiz ve PCR inhibitörlerinden arındırılmış olması, sonucu etkileyen en önemli adımlardan biridir. DNA ile ilgili daha ayrıntılı bilgi DNA izolasyon başlığı altında verilmektedir.
PCR yöntemi ile çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı özellikte 18-25 baz uzunluğunda, sentetik olarak sentezlenebilen oligonukleotidlere primer denir. Bu diziler çeşitli tasarım programları kullanılarak hedeflenen gen bölgesine özgü olarak sentezlenmektedir. Primer tasarımında genel olarak dikkat edilmesi gereken bazı noktalar bulunmaktadır. Öncelikle primer dizisi hedeflenen DNA’ya özgün olmalıdır, bu nedenle ayrıntılı bir sekans araştırması tavsiye edilmektedir, primerin 3’ ucunda 1-2 adet G/C nükleotidi bulunmalı aynı şekilde primer genelinde G/C oranı %45-55 olmalıdır. Forward ve reverse primerlerin seçiminde birbirlerine yakın Tm değerlerine sahip olmalarına, bu aralığın 55-65º C arasında olmasına özen gösterilmelidir. Ayrıca primerlerin kendi içinde veya birbirleri ile komplementer olmamalarına dikkat edilmelidir. Forward ve reverse primer arasındaki uzunluğun 100-600 baz olması tavsiye edilmektedir.
MWG firması tarafından sentezlenen primer ve problar, kullanıcıya liyofilize olarak teslim edilmektedir. Liyofilize ürünler firma tarafından gönderilen talimatlara uygun olarak distile su ile sulandırılır.
Firma tarafından gönderilen sulandırma kağıdında sentezlenen primere ait dizi, konsantrasyon, molekül ağırlık, Tm ve 100 pmol/uL stok primer hazırlanması için eklenmesi gereken distile su miktarı (volume for 100 pmol/uL) belirtilmektedir. Bu talimatlara uygun olarak hazırlanan 100 pmol/uL’lik stok primerin ayrı olarak saklanması, devamlı kullanım için 10 pmol/uL konsantrasyonda hazırlanmış seyreltik primerlerin kullanımı tavsiye edilmektedir. Bu şekilde stok primerin daha uzun ömürlü olarak saklanması sağlanacak ve kontaminasyon riski minimuma inecektir.
100 pmol/uL stok primerden, 100 uL 10 pmol/uL’lik primer solüsyonu hazırlamak için 90 uL distile su’ya 10 uL stok primer (100 pmol/uL) ilave edilir.
Primer çalışmalarında gerekli olabilecek bazı çevrimler; 1 nmol=1000 pmol, 1 uM=1 pmol/uL şeklinde belirtilebilir.
Farklı firmalardan elde edilen liyofilize primerlerin sulandırılması için ise primerin nmol cinsinden değerinin bilinmesi yeterlidir. Yukarıda belirtilen 1 nmol=1000 pmol eşitliği kullanılarak, sulandırma için eklenmesi gereken distile su miktarı hesaplanabilmektedir. Örnek olarak elinizdeki A primeri 21,5 nmol değerinde ise 1 nmol=1000 pmol eşitliği kullanılarak 21500 pmol değerini elde ederiz. 1 µl’de 100 pmol olmasını istediğimiz stok primerimizi hazırlamak için;
1 µl 100 pmol
X 21500 pmol denkleminden
X= (1 µl x 21500 pmol)/ 100 pmol = 215 µl distile su eklediğimizde 100 pmol/uL stok primer solüsyonu elde edilir.
Taq DNA polimeraz, tamamlayıcı DNA dizisinin sentezi sırasında serbest dNTP’ye (deoksiribonucleotid-trifosfat) ihtiyaç duymaktadır. Set dâhilinde 100 mM’lık stok solüsyonlar halinde bulunan dATP, dGTP, dTTP ve dCTP’ den eşit miktarda alınarak bir mikrosantrifüj tüp içerisinde pipet yardımı ile karıştırıldığında PCR için kullanıma hazır, 25 mM dNTP karışım elde edilmektedir. PCR reaksiyonu sırasında ortamda bulunması gereken ortalama dNTP miktarı 0,2-0,4 mM olarak belirtilmektedir. dNTP’ nin raf ömrünü uzatmak amacı ile kullanılacak miktarların porsiyonlar halinde bölünerek, dondurup çözme işleminin en aza indirilmesi tavsiye edilmektedir.
Taq DNA Polimeraz enzimi, ortamdaki dNTP’leri kullanarak kalıp DNA iplikçiğine tamamlayıcı bir DNA ipliğini meydana getirecek sentez reaksiyonunu katalizler. Enzim, tamamlayıcı DNA sentezini başlatmak için primerlere ihtiyaç duymaktadır. Sentezin yönü 5’ ucundan 3’ ucuna doğru olup, primerin serbest 3’ hidroksil ucuna ortamdaki dNTP’lerin fosfodiester bağları ile bağlanması sonucu yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır.
MgCl2 ortamda bulunan serbest dNTP’ler ile bir araya gelerek Taq DNA polimerazın tanıyabileceği çözünebilir bileşikler oluşturmaktadır. Mg+2’deki artış enzim aktivitesini etkilemekte ve çift zincirli DNA’nın Tm ısısını arttırmaktadır. Reaksiyonda bulunan fazla miktarda Mg+2, spesifik olmayan primer bağlanmalarına ve buna bağlı olarak da spesifik olmayan bantlara neden olabilmektedir. Ortamda bulunması gereken MgCl2 konsantrasyonu en yaygın olarak 1,5 mM kullanılmakla birlikte 1-5 mM arasında olmalıdır.
Toplam hacmin 50 µl olduğu standart bir PCR çalışmasında kullanılan ortalama değerler şu şekildedir;
Bileşen Miktar Son Konsantrasyon Ortalama Aralık
10X Buffer 5 µl 1X 1X
MgCl2 (25 mM) 3 µl 1,5 mM 1-5 mM
dNTP (10 mM) 1 µl 0,2 mM 0,2-0,4 mM
Primer F (10 pmol/µl) 1 µl 10 pmol/µl 0,01-0,1 µM
Primer R (10 pmol/µl) 1 µl 10 pmol/µl 0,01-0,1 µM
Taq DNA Polimeraz (5 u/µl) 0,25 µl 1,25 u 0,5-2,5 u
DNA 5 µl 100 ng 50-200 ng
Ultra Saf Su 50 µl’ye tamamlanacak kadar Ultra Saf Su
PCR yönteminde karşılaşılabilecek muhtemel problemler ve çözümleri nelerdir?
Çok fazla dNTP yada dejenere olmuş dNTP : Reaksiyondaki çok fazla dNTP PCR’ı inhibe eder. Ayrıca dNTP ısınma-soğuma döngülerine karşı hassastır. Bu nedenle sık sık dondurup çözme yerine ilk ambalajı porsiyonlayarak kullanmak dNTP’nin ömrünü uzatacak, reaksiyonunuzu olumsuz etkileme riskini düşürecektir.
Karışmamış MgCl2: MgCl2 solüsyonu kullanmaya başlamadan önce iyice karıştırılmalı, reaksiyonda da kullanırken, pipetaj ile homojen hale gelmesi sağlanmalıdır.
Yanlış MgCl2 konsantrasyonu: MgCl2 iyonları dNTP ile kompleks oluştururlar . Ayrıca polimeraz için de kofaktör rolü görürler. Bu nedenle konsantrasyonları çok önemlidir. İdeal olarak reaksiyon başına 1-5 mM MgCl2 olması gerekir.
PCR inhibitörleri: DNA’nızın temiz olduğundan emin olmalısınız çünkü izolasyon sonrası artık olarak kalabilecek kloroform, fenol, deterjan, EDTA vb. maddeler PCR’ı inhibe eder. Aynı şekilde polimerazın etkinliğini de değiştirebilirler. Bu nedenle DNA’nızı aynı anda pürifiye de edebilecek yöntemlerle izole etmeniz önerilir.
Çok fazla polimeraz enzimi: Fazla polimeraz enzimi PCR ürününüzde smear’a neden olur. Bir çok reaksiyonda 1 ünite Taq kullanılmaktadır ancak yine de reaksiyona uygun Taq miktarının kontrol edilerek kullanılması tavsiye edilir.
Yanlış primer konsantrasyonu: Çok az primer konulursa PCR ürünü elde edilemeyebilir. Çok fazla primer de jel üzerinde primer dimerine neden olabilir. Primer aralığı, her primer için genellikle 0,01-0,1 µM arasında olmalıdır.
Yanlış PCR programı: PCR programı, reaksiyonun en önemli aşamasıdır. Kullandığınız programın çoğaltmak istediğiniz gen bölgesine uyumlu olup olmadığını ve reaksiyonu başlatırken doğru program seçip seçmediğinizi mutlaka kontrol etmeniz tavsiye edilir. Ayrıca program içerisindeki en önemli aşama da hibridizasyon (annealing - primerin dizisine göre DNA bölgesine yapışma) sıcaklığıdır. Bu sıcaklığın, literatürden ve primerlerinizin bilgilerinden kontrol edilmesi önerilir.
Yanlış DNA miktarı: Çok fazla DNA tüm primerlere bağlanarak PCR’ı inhibe eder. Çok az konulursa da ürün tespit edilmeyebilir. Bu nedenle döngü sayısına da bağlı olarak ortalama 50 – 200 ng DNA koymanız yeterli olacaktır.
Yanlış primer tasarımı: Primer tasarımı yapılırken, primer dizisinin kendisi ile ve diğer primerle komplementer olmamasına ve çok uzun (>30 bp) olmamasına dikkat edilmelidir.
PCR, aynı zamanda allel-spesifik oligonükleotid (ASO) yöntemi kullanılarak da bilinen tek nokta mutasyonların (SNP) tespit edilmesinde kullanılmaktadır. Tipik bir ASO çalışması, ortak bir primer içeren iki tamamlayıcı reaksiyondan meydana gelmektedir. Her iki reaksiyon ortak primer dışında allel spesifik primer ve diğer PCR bileşenlerinden oluşmaktadır. İlk reaksiyon normal (wild-type) DNA dizisine spesifik, verilen bölgede mutant diziye zıt primer içermektedir. Benzer şekilde ikinci reaksiyon mutant diziye spesifik, normal (wild-type) DNA’ya uyumsuz primer içermektedir (Şekil 2).
Yöntem, uygun koşullar altında her reaksiyon tüpünde spesifik olarak gerçekleşen normal (wild-type) ve mutant amplifikasyonların değerlendirilmesine dayanmaktadır. Normal bir birey sadece ilk, normal reaksiyonunda amplifikasyon meydana getirirken, homozigot bireyde her iki reaksiyonda da amplifikasyon ürünü beklenmektedir. Homozigot mutant bireyde sadece ikinci reaksiyonda ürün elde edilecektir. PCR reaksiyonuna eklenecek internal kontrol çalışmanın doğruluğunun belirlenmesi açısından önemlidir.
PCR sonucu elde edilen amplifikasyon ürünleri nasıl değerlendirilir?
PCR’ın ardından elde edilen amplifikasyon ürünlerinin değerlendirmesi elektroforez yöntemi ile yapılmaktadır. Elektroforez yöntemi materyale ve amaca göre çeşitlilik göstermektedir. Elektroforezi yapılacak materyal PCR ürünü ise beklenen bant büyüklüğüne uygun olarak kullanılacak olan agaroz ve jel konsantrasyonu belirlenir. İlerleyen kısımlarda elektroforez protokolü daha detaylı bir şekilde anlatılmıştır.
Jel elektroforezi nedir?
DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla birlikte tüm laboratuarlarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden birisi jel elektroforezidir. DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerinde hareketine dayanmaktadır. Bu hareketin hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmanlarının ayrılabilmesini sağlamasıdır. UV ışığı altında fluoresan etki gösteren etidyum bromür (EtBr) boyasının kullanımı ile çok düşük konsantrasyonlarda (1–10 ng) olsa bile, DNA’nın jel üzerindeki yerini belirlemek mümkündür (Şekil 3).
Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmanları (5–500 baz) ve RNA moleküllerinin ayrımında kullanılır. Bu tip ayrım güçleri yüksek jeller, boyut bakımından birbirine çok yakın DNA fragmanlarının analizleri için uygundur. 1 Mb’ dan(megabaz) daha büyük doğrusal çift iplikli DNA molekülleri, jelin por büyüklüğünün doğrusal DNA’nın hareketine yeterli olmaması nedeniyle agaroz jelde aynı hızda hareket ederler. Bunun için Pulse field jel elektroforezi önerilir. Bu yöntemde DNA molekülleri bir elektriksel akıma uygun olarak hareket ederken kısa bir süre sonra farklı bir akıma uygunluk göstermek durumunda kalırlar. Bu şekilde küçük moleküllerin elektriksel alan değişimlerine daha hızlı ve daha kolay uyum sağlamalarından yararlanılarak ayrım elde edilir.
Agaroz jel elektroforezi nasıl hazırlanır?
Örnek olarak %1-2’lik bir agaroz jel hazırlamak için; 100ml 0,5X TAE ve 1–2 g agaroz bir erlen içerisine ilave edilerek mikrodalga fırında agaroz tamamen çözülünceye kadar kaynatılır, bu aşamada jelin taşmasına engel olmak için yaklaşık 500 ml’lik bir erlen kullanılması tavsiye edilmektedir. Agaroz tamamen çözündükten sonra biraz soğuması beklenmeli fakat katılaşmamasına dikkat edilmeli ve yaklaşık 5 µl EtBr (10 mg/ml) solüsyonu eklenmelidir. Tarakların doğru olarak yerleştirilip yerleştirilmediği kontrol edildikten sonra jel elektroforez tepsisine üzerinde herhangi bir kabarcık kalmamasına dikkat edilerek dökülmelidir. Agaroz jel bu şekilde 15–30 dk bekletildikten sonra kullanılabilir. EtBr güçlü bir mutajenik ajan olduğu için jel dökme işleminin, havalandırılması uygun odalarda ya da çeker ocaklı kabinler içerisinde yapılması tavsiye edilir.
Agaroz jelin tamamen donmasının ardından kuyunun örnek yükleme kapasitesine uygun olarak 6x jel yükleme solüsyonu ve bunun 6 katı oranında örnek (1’e 6 oranında) karıştırılarak ilgili kuyuya yüklenir, jel yükleme solüsyonu örneğin kuyuya oturmasına ve elektroforez sırasında örneğin takip edilmesine imkân vermektedir. Ayrıca bant büyüklüklerinin karşılaştırılabilmesi amacı ile bant büyüklükleri bilinen bir DNA standardının da jele yüklenmesi tavsiye edilmektedir. Ortalama olarak 100-200V arasında 30 dk yürütülebilmekle birlikte, jelin yürütülme süresi kullanılan elektroforez tankının büyüklüğüne, kullanılan agaroz çeşidine ve analiz edilen bant büyüklüğüne bağlı olarak farklılık göstermektedir. Elektroforez işleminin ardından UV ışık altında görüntüleme sistemi ile bantların değerlendirmesi yapılabilmektedir.
RFLP nedir?
Restriksiyon enzimleri kullanılarak DNA’nın farklı büyüklükteki fragmanlara ayrılması RFLP (Restriksiyon Fragment Length Polymorphism) olarak adlandırılır. Bu yöntem polimorfizm çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır.
Restriksiyon enzimleri, DNA üzerinde yaklaşık 5-10 baz uzunluğunda belirli bir nükleotid dizisini tanıyarak bu noktada kesim yapar ve DNA’yı ikiye ayırır. İlki Hamilton tarafından keşfedilen Hind III başta olmak üzere, 200 den fazla farklı bakteri türünden, her biri bakterinin orijinal isminin kısaltması ile anılan çok sayıda restriksiyon enzimi bulunmuştur. Her DNA molekülü farklı kesim noktalarına sahip bölgeleri içerir. Bu DNA bölgeleri aynı restriksiyon enzimi kullanılarak kesildiğinde bireylerin taşıdığı mutasyonlara bağlı olarak değişik miktar ve uzunlukta parçalar elde edilebilmektedir.
RFLP yöntemi hangi aşamalardan oluşmaktadır?
Yöntem temelde dört adımdan meydana gelmektedir; DNA izolasyonu, PCR, elde edilen PCR ürününün restriksiyon enzimleri kullanılarak kesimi ve elektroforez ile kesilen fragmanların ayrımı, görüntülenmesi.
RFLP analizinin daha kolay uygulanır olabilmesi açısından seçilen enzim büyük önem taşımaktadır. Seçilen enzimin kesilmek istenilen DNA’yı birden fazla noktada kesmesi sonucu oluşan çok sayıda ve birbirine yakın büyüklükte ki fragmanlar analizi zorlaştırmaktadır. RFLP tek nokta mutasyon analizlerinde sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Tek nokta mutasyonları ile meydana gelen veya zarar gören enzim kesim noktaları kullanılarak bu bölgelerde oluşan mutasyonları tespit etmek mümkündür. Mutasyon noktasını çevreleyen primerler ile gerçekleştirilen PCR reaksiyonunun ardından tek nokta mutasyon bölgesinden kesen bir enzim seçilerek analiz edilir.
RFLP bileşenleri nelerdir?
PCR çalışmasının ardından gerçekleştirilecek enzim kesimleme işlemi için gerekli olan dört ana madde vardır: PCR ürünü, elde edilen PCR ürününü belirli noktalardan kesen restriksiyon enzimi, enzime ait 10X solüsyon ve BSA (Bovine serum albumin). BSA bazı enzimler ile birlikte kullanıldığı zaman enzim aktivitesini arttırmaktadır.
Toplam hacmin 20 µl olduğu standart bir enzim kesiminde kullanılan ortalama değerler şu şekildedir;
Bileşen Miktar
10X Buffer 2 µl
Enzim* 2u
PCR ürünü 10 µl
BSA (10mg/ml)** 2,5 µl
Ultra Saf Su 20 µl’ye tamamlanacak kadar Ultra Saf Su
* Kullanılacak enzim miktarı, enzime ve çalışmaya göre farklılık göstermektedir. 2 u olarak verilen enzim miktarı ortalama bir değerdir.
** BSA, enzimle birlikte verilmektedir ve 10 mg/ml olarak 100X konsantrasyona sahiptir, çalışma sırasında kullanılması gereken değer yaklaşık olarak 0,1 mg/ml (1X) dir.
5’ NUKLEAZ-PCR ANALİZ PROTOKOLÜ
Floresan boyalar kullanılarak eş-zamanlı olarak DNA’nın çoğaltılması ve saptanması işlemi “Real-Time PCR” olarak adlandırılmaktadır. Sistem her döngüde oluşan PCR ürünleri ile doğru orantılı olarak artan floresan ışıma sinyallerinin tespitine dayanmaktadır. Bu ışıma sinyali, başarılı olarak tamamlanan her PCR döngüsü ile doğru orantılı olarak artmaktadır.
Real-time PCR metodunun özelliği amplifikasyon reaksiyonun gerçekleştirilmesi ve görüntülenmesi için kullanılan cihaz ve kimyasallara bağlıdır. Bu amaçla birçok farklı kimyasal kullanılabilmektedir: Ethidyum bromid, SYBR Green I gibi boyalar ve TaqMan, Molecular Beacon, Scorpion, Fluorescence Resonance Enerji Transfer probları.
5’ Nukleaz PCR nedir?
5’ nukleaz (TaqMan®) yöntemi Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır. TaqMan probu yaklaşık 23–30 baz uzunluğunda bir oligonükleotid dizisidir. Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya bulunmaktadır. 3’ ucunda bulunan quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir. Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit edilmektedir (Şekil 4).
Bu yöntemde kullanılan problar farklı floresan değerli boyalarla işaretlenerek multipleks çalışmalara imkân vermektedir. Primerlerin çoğalttığı bölgede ışımanın meydana gelmesi işaretli probun hedef bölgeye hibridizasyonu ile mümkün olmakta, bu şekilde daha spesifik ve doğru sonuçlar elde edilmektedir.
Şekiller
NOT: Yukarıda anlatılan tüm protokoller laboratuar koşullarına göre farklılıklar gösterebilir. Ayrıntılı bilgi için research@drzeydanli.com.tr adresine mail atabilirsiniz.